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本生闡述:培養(yǎng)細(xì)胞需注意的細(xì)節(jié)?

更新時(shí)間:2022-09-27    點(diǎn)擊次數(shù):4553

  本生闡述:培養(yǎng)細(xì)胞需注意的細(xì)節(jié)?

 

  培養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)育孩子一樣,要精心照料,用心呵護(hù)。每天都去看看它們,滿足它們所需要的物質(zhì)需求,防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外,還要注意很多小細(xì)節(jié),以免開展重復(fù)的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致不必要的人力物力浪費(fèi)。

  那培養(yǎng)細(xì)胞都要注意哪些小細(xì)節(jié)呢?就讓我們一起來看看吧!

  1.細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源

  不同的細(xì)胞的培養(yǎng)基是不相同的,對于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞來說,營養(yǎng)配方一般為:90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染,可以適時(shí)加1%雙抗,抗生素的使用應(yīng)為短期。

  Q:細(xì)胞培養(yǎng)基配方如何選擇?

  A: 一般購買細(xì)胞時(shí),針對不同的細(xì)胞株,會(huì)有詳細(xì)的介紹,包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基,在胎牛血清的選擇上也可以選用品牌、來源可靠的胎牛血清,能提供較好的營養(yǎng)成分,以滿足細(xì)胞株生長的需要。

  Q:如果細(xì)胞生長緩慢,需要增加血清比例嗎?

  A:可以。

  2.細(xì)胞生長的環(huán)境

  舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。需要合適的器皿,不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等,進(jìn)入合適的恒溫箱培養(yǎng),如腫瘤細(xì)胞就需37℃,5%CO2的恒溫箱中生長。

  Q:細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇?

  A:根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板,如MTS用96孔板,細(xì)胞爬片用24孔,流式分析用6空等

  而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶,就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大,主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些,數(shù)量也會(huì)大一些,但是成本也相對較高,因此沒有特殊要求時(shí),一般用培養(yǎng)皿即可。

  Q:血清是否要滅活處理,保證環(huán)境無菌?

  A:這取決于您的應(yīng)用。

  滅活過程中,會(huì)導(dǎo)致血清中某些成分被破壞,如氨基酸,維生素,生長因子等。所以只有在您的實(shí)驗(yàn)對血清有特殊要求時(shí),才會(huì)考慮對血清進(jìn)行滅活處理。如您的實(shí)驗(yàn)對血清中的某種組分敏感,需要去除該組分。常見的情況是需要去除血清中的補(bǔ)體蛋白,因?yàn)檠a(bǔ)體在機(jī)體中參與細(xì)胞殺傷,巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化,肥大細(xì)胞和血小板組胺釋放,平滑肌收縮等過程,所以一般在免疫學(xué)相關(guān)研究中及肌細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需要對血清進(jìn)行滅活處理。

  3.細(xì)胞復(fù)蘇與凍存

  細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存的細(xì)胞解凍之后再重新培養(yǎng),細(xì)胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程。

  Q:細(xì)胞復(fù)蘇后,為什么很多難以貼壁?

  A:忽略培養(yǎng)基的問題,主要考慮細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記重要的融化速度要快,可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管,使之盡快通過易受損的溫度段(-5~0℃)。

  細(xì)胞凍存則是將細(xì)胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境,降低細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng),限度的保存細(xì)胞活力,以便長期存儲(chǔ)。

  Q:目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方?

  A:目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑,細(xì)胞凍存液的配方有很多種,如培養(yǎng)基:血清:DMSO=7:2:1或8:1:1或5:4:1,或直接用血清:DMSO=9:1,一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力,復(fù)蘇存活率在80%~90%以上。

  4.細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

  細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖,培養(yǎng)皿空間有限,細(xì)胞過密生長就會(huì)受到抑制,影響細(xì)胞的狀態(tài),因此我們要把細(xì)胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里,這樣細(xì)胞才能生長的好。

  Q:細(xì)胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對數(shù)期細(xì)胞?

  A: 細(xì)胞的生長和分裂,一般遵循以下模式:停滯期,對數(shù)期(指數(shù)期),平穩(wěn)期(平臺(tái)期)和衰退期。為了確?;盍?,遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定,必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期。一般細(xì)胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

  除了上述幾個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外,細(xì)胞培養(yǎng)還有很多小問題如下:

  Q:培養(yǎng)基多久換一次?

  A: 正常情況下,培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5~6.6條件下,培養(yǎng)基變黃,說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量,細(xì)胞會(huì)脫落死亡,需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時(shí)1~2天換一次,生長緩慢時(shí),3~4天亦可。針對復(fù)蘇后的細(xì)胞,建議隔天換液。

  Q:血清應(yīng)如何融解?

  A:從冰箱中取出血清,放于2-8℃融化,融化過程中不時(shí)旋轉(zhuǎn)(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

  Q:如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等,如何處理?

  A:可以考慮如下操作:首先,倒掉舊的培養(yǎng)基,用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次,再開始正式的消化、吹打。其次,把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

  Q:血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

  A:多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成,常見的原因之一是融化過程中,脂蛋白聚集所致。該現(xiàn)象一般不會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量??梢?00g離心5分鐘,取上清,然后過濾。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑,一般的是0.22um PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞,建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清。

  總之,細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基石,留心各種細(xì)節(jié)問題,嚴(yán)守滅菌處理的程序,保護(hù)好自己養(yǎng)的細(xì)胞,這樣才能快樂地進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

  培養(yǎng)細(xì)胞需注意哪些小細(xì)節(jié)?本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。

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